摘要

特應(yīng)性皮炎以慢性炎癥、屏障功能障礙和瘙癢為特征，搔抓等外界刺激會加重上述癥狀。

2024年11月，九州大學(xué)醫(yī)學(xué)研究生院皮膚科的Takeshi Nakahara等研究團隊在《International Journal of Molecular Sciences》期刊上發(fā)表了題為“Extracellular ATP Contributes to Barrier Function and Inflammation in Atopic Dermatitis: Potential for Topical Treatment of Atopic Dermatitis by Targeting Extracellular ATP"的研究。該研究探討了細胞外三磷酸腺苷在特應(yīng)性皮炎病理生理中的作用，并評估了ATP釋放抑制劑氯膦酸鹽對特應(yīng)性皮炎的藥物潛力。

研究表明，細胞外ATP會降低角質(zhì)形成細胞中絲聚合蛋白的表達，而絲聚合蛋白是維持皮膚屏障完整性的關(guān)鍵蛋白，因此細胞外ATP會損害皮膚屏障功能。此外，白細胞介素-4和機械刺激會觸發(fā)ATP釋放，進而促進免疫細胞產(chǎn)生細胞因子和趨化因子，加劇炎癥反應(yīng)。氯膦酸鹽可通過抑制ATP釋放，恢復(fù)角質(zhì)形成細胞中的絲聚合蛋白水平，減少樹突狀細胞產(chǎn)生胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子，并改善特應(yīng)性皮炎小鼠模型的癥狀。這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向細胞外ATP有望成為改善特應(yīng)性皮炎皮膚屏障功能和減輕炎癥的新研究策略。未來研究應(yīng)進一步探索靶向ATP在臨床場景中的長期療效與安全性。

研究材料與儀器

材料

細胞、ATP、IL-4、氯膦酸鹽、MC903、熒光素-熒光素酶試劑、TRIzol試劑、RNeasy Plus Micro Kit、PrimeScript RT 試劑試劑盒、TB Green Premix Ex Taq、鼠源CCL17/TARC ELISA試劑盒、中性福爾馬林、乙醇、Dulbecco氏磷酸鹽緩沖液

實驗動物：8周齡雌性C57BL/6小鼠

儀器

熒光素-熒光素酶檢測相關(guān)設(shè)備、DTX 800多模式檢測儀、CFX Connect實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)、數(shù)字卡尺、蘇木精-伊紅染色相關(guān)設(shè)備、ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀、GraphPad PRISM 5軟件。

 ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀

實驗過程

體外實驗

1. 細胞培養(yǎng)：正常人類表皮角質(zhì)形成細胞在添加牛垂體提取物、重組人表皮生長因子等成分的KGM-Gold培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞融合度達70%–80%時傳代，取第三代細胞進行后續(xù)處理。分離C57BL/6小鼠骨髓細胞，在含粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，第10天收集非貼壁細胞，通過CD11c免疫磁珠陽性分選獲得純度95%–97%的骨髓來源樹突狀細胞。

2. 體外角質(zhì)形成細胞劃痕模型建立：將正常人類表皮角質(zhì)形成細胞接種于6孔板，待細胞形成完整單層后，用1000μL移液槍頭劃痕，劃痕后孵育15分鐘用于檢測細胞外ATP，孵育24小時用于熒光定量PCR檢測。

3. 細胞外ATP濃度測量：收集細胞培養(yǎng)上清液，離心后取上清，加入熒光素-熒光素酶試劑，通過化學(xué)發(fā)光法檢測ATP濃度。

4. 熒光定量PCR檢測：提取細胞或小鼠耳部皮膚組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用TB Green Premix Ex Taq進行實時熒光定量PCR，檢測絲聚合蛋白、TARC及各類細胞因子的mRNA表達水平。

5. 酶聯(lián)免疫吸附試驗：收集骨髓來源樹突狀細胞培養(yǎng)上清液，使用鼠源CCL17/TARC ELISA試劑盒檢測TARC蛋白含量。

體內(nèi)實驗

1. 塵螨抗原誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎模型建立：將小鼠分為對照組、特應(yīng)性皮炎組、特應(yīng)性皮炎+氯膦酸鹽組。特應(yīng)性皮炎組和特應(yīng)性皮炎+氯膦酸鹽組小鼠雙耳涂抹含MC903的乙醇溶液，5小時后特應(yīng)性皮炎+氯膦酸鹽組涂抹氯膦酸鹽溶液，特應(yīng)性皮炎組涂抹溶媒；對照組涂抹乙醇。連續(xù)5天上述處理后，兩組均每日涂抹對應(yīng)試劑至第10天。

2. 小鼠耳部厚度測量：每日使用數(shù)字卡尺測量小鼠耳部厚度，記錄變化情況。

3. 組織學(xué)檢查：取小鼠耳部皮膚，用10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片，進行蘇木精-伊紅染色，觀察表皮厚度和真皮內(nèi)炎癥細胞浸潤情況，統(tǒng)計炎癥細胞數(shù)量和表皮厚度平均值。

4. 經(jīng)表皮失水量測量：使用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測量儀，在標準溫濕度環(huán)境下測量小鼠皮膚病變部位的經(jīng)表皮失水量。

使用Vapo Scan儀器在第0、2、4、6天測量病灶處 TEWL

5. 統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，采用單因素方差分析結(jié)合Bonferroni多重比較檢驗分析組間差異，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)論

細胞外ATP會降低角質(zhì)形成細胞中絲聚合蛋白的表達，損害皮膚屏障功能；IL-4和搔抓等機械刺激會促進角質(zhì)形成細胞、樹突狀細胞釋放ATP，進而加劇特應(yīng)性皮炎的炎癥反應(yīng)。而氯膦酸鹽可通過抑制囊泡核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白來阻斷ATP釋放，能夠恢復(fù)IL-4或搔抓導(dǎo)致的絲聚合蛋白表達下降，減少樹突狀細胞產(chǎn)生TARC。外用氯膦酸鹽可改善塵螨抗原誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎小鼠模型的耳部腫脹、紅斑、鱗屑等癥狀，降低表皮厚度和炎癥細胞浸潤程度，改善皮膚屏障功能。靶向細胞外ATP有望成為特應(yīng)性皮炎研究新方向，既能改善慢性癥狀，也可能緩解由外界刺激引發(fā)的急性加重癥狀。